German Abstract, FWF Project 22406 Alkylgylcerol Monooxygenase: Cloning and Biochemistry,
Ernst R. Werner, Division of Biological Chemistry, Biocenter, Medical University of Innsbruck
Im menschlichen Körper kommt eine Vielzahl verschiedener Fettstoffe vor, die den Baustein Glycerin als Grundstruktur enthalten. Die Glycerinderivate, bei denen langkettige Kohlenstoffreste mit Esterbindungen gebunden sind, wurden bereits eingehend und gut untersucht. Jene mit einer Etherbindung sind weniger gut untersucht, und über ihren Stoffwechsel ist wenig bekannt. Sie kommen im Säugetierkörper in vielen Geweben vor und spielen wichtige Rollen z.B. in der Entwicklung des Gehirns, in der Reifung von Samenzellen und zum Schutz des Auges vor Kataraktbildung.
Alkylglycerol Monooxygenase (Glyceryl Ether Monooxygenase, E.C. 1.14.16.5) ist das einzige bekannte Enzyme, das die Etherbindung zwischen dem Alkylrest und dem Glycerin spalten kann. Alkylglycerol Monooxygenase bildet damit einen entscheidenden Schritt im Abbau der Etherlipide. Die Sequenz dieses Enzyms ist noch nicht bekannt, und deshalb ist eine Erforschung der Biochemie und der physiologischen Rolle dieses Schrittes des Etherlipidabbaus derzeit nicht möglich.
Ziel des vorliegenden Projektes ist es nun, der Alkylglycerol Monooxygenase eine Sequenz zuzuordnen, und damit eine Erforschung der Biochemie dieses Enzyms mit den Methoden des Standes der Technik zu ermöglichen. Dazu haben wir im vorangegangenen Projekt 19764 entscheidende Vorarbeiten geleistet. Wir haben Techniken entwickelt, dieses instabile Enzym mit hoher Empfindlichkeit nachzuweisen, und aus Zellmaterial effektiv zu extrahieren. Um die Sequenz zuzuordnen, planen wir, eine Suche mit funktionelle Expression in Xenopus laevis Oocyten durchzuführen. Mit dieser Technik sind auch schon anderen Enzymen, deren Reinigung nicht möglich war, Sequenzen zugeordnet worden. Wir konnten den entscheidenden Schritt dieser Technik bereits erfolgreich durchführen und zeigen, dass nach Injektion von Boten Ribonucleinsäure aus Rattenleber Xenopus Oocyten eine Tetrahydrobiopterin-abhängige Alkylglycerol Monooxygenase Aktivität exprimieren. Mit Standardmethoden werden wir davon ausgehend die Boten Ribonucleinsäure fraktionieren, und die Sequenz zuordnen können.
Nach der Zuordnung der Sequenz planen wir, die Biochemie des Enzyms näher zu studieren. Wir wollen feststellen, welche Aminosäurereste für die Aktivität und welche für die Bindung des Cofaktors Tetrahydrobiopterin wichtig sind. Dazu planen wir, das Enzym rekombinant herzustellen und zu reinigen, und einzelne Aminosäurereste gezielt auszutauschen. Weiters wollen wir Bindungspartner des Enzyms finden. Dazu wollen wir zwei Methoden einsetzen, das Split Ubiquitinsystem der Hefe, und Affinitäts-chromatographische Reinigung von Proteinkomplexen aus transifizierten Säugetierzellen.
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